Александрийская библиотека не была связана с какой-либо конкретной философской школой, и, следовательно, ученые, которые учились там, имели значительную академическую свободу. Однако они были подчинены власти короля.

Вероятно, апокрифическая история рассказана о поэте по имени Сотадес, который написал непристойную эпиграмму, высмеивающую Птолемея II за женитьбу на его сестре Арсинои II.

Говорят, что Птолемей II заключил его в тюрьму и, после того как он сбежал, запечатал его в свинцовой банке и бросил в море. В качестве религиозного центра Мусейон руководил священник из муз, известный как эпистат, который был назначен царем так же, как священники, управлявшие различными египетскими храмами.

Сама Библиотека была направлена ​​ученым, который служил в качестве главного библиотекаря, а также наставником сына короля.

Первым зарегистрированным главным библиотекарем был Зенодот Эфесский (жил ок. 325 - ок. 270 г. до н.э.). Основная работа Зенодота была посвящена созданию канонических текстов для поэм Гомера и ранних греческих лирических поэтов.

Большая часть того, что известно о нем, взята из более поздних комментариев, в которых упоминаются его предпочтительные чтения отдельных отрывков.

Зенодот, как известно, написал глоссарий редких и необычных слов, который был организован в алфавитном порядке, что делает его первым человеком, который использовал алфавитный порядок в качестве метода организации.

Поскольку собрание в Александрийской библиотеке, по-видимому, было организовано в алфавитном порядке по первой букве имени автора с самого раннего возраста, Кассон приходит к выводу, что весьма вероятно, что Зенодот был тем, кто организовал его таким образом.

Система алфавитизации Zenodotus, однако, использовала только первую букву слова, и только во втором веке нашей эры, как известно, кто-либо применял тот же метод алфавитизации к остальным буквам слова.

Тем временем ученый и поэт Каллимах составил «Пинаки», каталог из 120 книг различных авторов и все их известные произведения.

Пинаки не сохранились, но сохранилось достаточно ссылок на него и его фрагментов, чтобы позволить ученым восстановить его базовую структуру. Pinakes был разделен на несколько разделов, каждый из которых содержал записи для писателей определенного жанра литературы.

Самое основное разделение было между авторами поэзии и прозы, с каждым разделом, разделенным на меньшие подразделы. В каждом разделе перечислены авторы в алфавитном порядке.

Каждая запись включала в себя имя автора, имя отца, место рождения и другую краткую биографическую информацию, иногда включая псевдонимы, по которым был известен этот автор, а затем полный список всех известных работ этого автора. Записи для плодовитых авторов, таких как Эсхил, Еврипид, Софокл и Феофраст, должны были быть очень длинными, занимая несколько столбцов текста. Хотя Каллимах делал свою самую известную работу в Александрийской библиотеке, он никогда не занимал там должность главного библиотекаря.

Ученик Каллимаха Гермипп из Смирны написал биографии, Филостефан из Кирены изучал географию, а Истрос (возможно, также из Кирены) изучал чердаки Аттики. В дополнение к Большой библиотеке, много других небольших библиотек также начали возникать по всему городу Александрии.

После того, как Зенодот умер или ушел в отставку, Птолемей II Филадельф назначил Аполлония Родосского (жил ок. 295 - 215 гг. До н.э.), уроженца Александрии и ученика Каллимахуса, вторым главным библиотекарем Александрийской библиотеки.

Филадельф также назначил Аполлония Родосского наставником своего сына, будущего Птолемея III Евергета. Аполлоний Родосский известен прежде всего как автор «Аргонавтики», эпической поэмы о путешествиях Ясона и Аргонавтов, которая сохранилась до наших дней в своей полной форме.

Argonautica отображает обширные знания Аполлония по истории и литературе и намекает на широкий спектр событий и текстов, одновременно подражая стилю гомеровских стихов.  Некоторые фрагменты его научных трудов также сохранились, но сегодня он, как правило, более известен как поэт, чем как ученый.

Согласно легенде, во время библиотечного дела Аполлония математик и изобретатель Архимед (жил ок. 287 - 212 гг. До н.э.) приехал в Александрийскую библиотеку. Говорят, что во время своего пребывания в Египте Архимед наблюдал взлет и падение Нила, что привело его к созданию винта Архимеда, который можно использовать для транспортировки воды из низменных тел в ирригационные канавы. Архимед позже вернулся в Сиракузы, где он продолжал делать новые изобретения.

Согласно двум поздним и в значительной степени ненадежным биографиям, Аполлоний был вынужден уйти в отставку со своего поста главного библиотекаря и переехал на остров Родос (после чего он берет свое имя) из-за враждебного приема, который он получил в Александрии в отношении первого проекта его аргонавтика. Скорее всего, отставка Аполлония произошла из-за восхождения Птолемея III Евергета на престол в 246 г. до н.э.

Третий главный библиотекарь, Эратосфен Киренский (жил ок. 280-с. 194 до н.э.), сегодня наиболее известен своими научными работами, но он также был литературоведом. Самой важной работой Эратосфена был его трактат "География", который первоначально был в трех томах. Само произведение не сохранилось, но многие его фрагменты сохранились посредством цитат в трудах более позднего географа Страбона. Эратосфен был первым ученым, применившим математику к географии и картографии, и в своем трактате «Об измерении Земли» он вычислил окружность Земли и был всего лишь на несколько сотен километров. Эратосфен также подготовил карту всего известного мира, которая включала информацию, взятую из источников, хранящихся в Библиотеке, в том числе отчеты о походах Александра Македонского в Индию и отчеты, написанные членами экспедиций Птолемеев на охоту на слонов вдоль побережья Восточной Африки.

Эратосфен был первым человеком, который продвинул географию к научной дисциплине. Эратосфен считал, что постановка поэм Гомера была чисто мнимой, и утверждал, что целью поэзии было «захватить душу», а не дать исторически точный отчет о реальных событиях. Страбон цитирует его как саркастически прокомментировавшего: «Человек может найти места странствий Одиссея, если придет день, когда он найдет кожевника, который сшил козлиную шкуру ветра». Тем временем другие ученые из Библиотеки Александрия также проявляла интерес к научным предметам. Бахкиус Танагрский, современник Эратосфена, отредактировал и прокомментировал медицинские труды Гиппократа. Врачи Герофил (жив. Ок. 335 - 280 г. до н.э.) и Эразистрат (ок. 304 - ок. 250 г. до н.э.) изучали анатомию человека, но их исследованиям препятствовали протесты против вскрытия человеческих трупов, что считалось аморальным.

По словам Галена, примерно в это же время Птолемей III запросил у афинян разрешение заимствовать подлинные рукописи Эсхила, Софокла и Еврипида, для которых афиняне требовали огромного количества пятнадцати талантов (1000 фунтов, 450 кг) драгоценного металла. в качестве гарантии того, что он вернет их. У Птолемея III были дорогие копии пьес, выполненных на папирусе высочайшего качества, и он послал афинянам копии, сохранив оригинальные рукописи для библиотеки и сообщив афинянам, что они могут сохранить свои таланты.

Эта история также может быть ошибочно истолкована, чтобы показать силу Александрии над Афинами во время династии Птолемеев. Эта деталь проистекает из того факта, что Александрия была искусственным двунаправленным портом между материком и островом Фарос, приветствуя торговлю с Востока и Запада, и вскоре оказалась международным центром торговли, ведущим производителем папируса и достаточно скоро, книги.

По мере расширения библиотеки ей не хватало места для размещения свитков в ее коллекции, поэтому во время правления Птолемея III Эвергета она открыла спутниковую коллекцию в Серапеуме Александрии, храме греко-египетского бога Сераписа, расположенном недалеко от Королевский дворец.