Аристофан Византийский (жил ок. 257-180 до н.э.) стал четвертым главным библиотекарем около 200 г. до н.э. Согласно легенде, записанной римским писателем Витрувием, Аристофан был одним из семи судей, назначенных на конкурс поэзии, организованный Птолемеем III Euergetes. Все шесть других судей одобрили одного конкурента, но Аристофан одобрил того, кому аудитория понравилась меньше всего. Аристофан заявил, что все поэты, за исключением того, которого он выбрал, совершили плагиат и поэтому были дисквалифицированы. Король потребовал, чтобы он доказать это, поэтому он извлек тексты, которые авторы плагиат из библиотеки, находя их по памяти. Из-за его впечатляющей памяти и усердия Птолемей III назначил его главным библиотекарем.

Считается, что библиотечное дело Аристофана Византийского открыло более зрелую фазу истории Александрийской библиотеки. На этом этапе истории библиотеки литературная критика достигла своего пика и стала доминировать в научной деятельности библиотеки. Аристофан Византийский отредактировал поэтические тексты и ввел разделение стихов на отдельные строки на странице, так как они ранее были написаны так же, как проза. Он также изобрел систему греческих диакритиков, написал важные работы по лексикографии,и ввел ряд знаков для текстовой критики. Он написал введение во многие пьесы, некоторые из которых сохранились в частично переписанных формах. Пятым главным библиотекарем был неизвестный человек по имени Аполлоний, которого греческий эпитет знает: ὁ εἰδογράφος («классификатор форм»). Один поздний лексикографический источник объясняет этот эпитет как относящийся к классификации поэзии на основе музыкальных форм.

В начале второго века до нашей эры несколько ученых в Александрийской библиотеке изучали работы по медицине. Зевсису Эмпирику приписывают письменные комментарии к Гиппократовому корпусу, и он активно работал над закупкой медицинских материалов для коллекции Библиотеки. Ученый по имени Птолемей Эпитеты написал трактат о ранах в поэмах Гомера, предмет, пересекающий грань между традиционной филологией и медициной.
Тем не менее, также в начале второго века до нашей эры политическая власть в Птолемеевском Египте начала уменьшаться. После битвы при Рафии в 217 г. до н.э. власть Птолемеев становилась все более нестабильной. Были восстания среди сегментов египетского населения, и в первой половине второго века до нашей эры связь с Верхним Египтом стала в значительной степени нарушена. Правители Птолемея также начали подчеркивать египетский аспект своей нации, а не греческий. Следовательно, многие греческие ученые начали покидать Александрию в более безопасные страны с более щедрым покровительством.

Аристарх Самофракийский (жил ок. 216 - ок. 145 до н.э.) был шестым главным библиотекарем.

Он заработал репутацию величайшего из всех древних ученых и создал не только тексты классических стихов и произведений прозы, но и полные гипомнематы, или длинные, отдельно стоящие комментарии к ним. Эти комментарии обычно цитируют отрывок из классического текста, объясняют его значение, определяют любые необычные слова, используемые в нем, и комментируют, действительно ли слова в отрывке были теми, которые использовались оригинальным автором, или были ли они более поздними интерполяциями, добавленными писцами. .Он внес большой вклад в различные исследования, но особенно в изучение поэм Гомера, и его редакционные мнения широко цитируются древними авторами как авторитетные. Часть одного из комментариев Аристарха к «Историям Геродота» сохранилась в виде фрагмента папируса. Однако в 145 г. до н.э. Аристарх попал в династическую борьбу, в которой он поддерживал Птолемея VII Неоса Филопатора как правителя Египта. Птолемей VII был убит и сменил Птолемея VIII Физкона, который немедленно принялся наказывать всех тех, кто поддерживал его предшественника, заставляя Аристарха бежать из Египта и укрыться на острове Кипр, где он вскоре умер. Птолемей VIII изгнал всех иностранных ученых из Александрии, заставив их рассредоточиться по всему Восточному Средиземноморью.