Массовое культивирование клеток млекопитающих

(Статья из журнала "В мире науки", март 1983 г.)

скачать статью полностью

ДЖОЗЕФ ФИДЕР И УИЛЬЯМ Р.ТОЛБЕРТ

Культивирование клеток человека или других млекопитающих — часто наилучший путь получить некоторые соединения, важные в научно-исследовательской работе, медицинской практике или в промышленности. Однако вырастить большое количество таких клеток в искусственной среде совсем не просто. Хорошо освоенные приемы технической микробиологии годятся лишь для бактерий, дрожжей и грибов. Клетка одноклеточного организма с ее прочной оболочкой представляет собой вполне автономную в смысле метаболизма систему. Для ее питания нужны относительно простые вещества: для бактерий, например, достаточны лишь глюкоза и простые соли. Микроорганизмы прекрасно размножаются, плавая в жидкой питательной среде в ферментерах объемом до 200 ООО л. Они хорошо переносят даже условия густых клеточных суспензий, которые получаются при активном размножении микроорганизмов, причем энергичное перемешивание таких суспензий механическими приспособлениями клеткам не вредит.

Совсем другое дело — клетки млекопитающих. Они крупнее большинства микробных клеток, сложнее устроены и менее стойки к внешним воздействиям. Тонкая цитоплазматическая мембрана животной клетки не защищена прочной клеточной стенкой. Потребности таких клеток в питательных веществах разнообразнее, к тому же они до конца еще не изучены. Клетка млекопитающего в отличие от свободно живущего одноклеточного организма всегда часть какой-либо специализированной ткани, она зависит от жизнедеятельности других клеток и от работы систем циркуляции жидкостей организма — именно таким путем обеспечиваются для каждой клетки оптимальные и стабильные условия ее существования. Выделение из состава ткани и культивирование в искусственной среде крайне неблагоприятны для

нее. Большинство животных клеток вообще не растет в суспензионных культурах, им надо прикрепляться к какой-нибудь поверхности. Многие годы разрабатывались методы выращивания клеток млекопитающих в небольших количествах в условиях лаборатории. Наладить массовое культивирование оказалось гораздо труднее.

Потребность в методах массового выращивания клеток млекопитающих сегодня очень велика. Возьмем, к примеру, интерферон. Это вещество выделяют клетки животных, оно способно подавлять вирусную инфекцию. Интерферон открыли еще в 1957 г., но его действенность при лечении заболеваний до сих пор не доказана окончательно, потому что до недавнего времени не умели культивировать помногу клетки млекопитающих, в которых можно индуцировать синтез интерферона.

Еще пример. Моноклональные антитела к специфическим белкам образуются в так называемых гибридомах, т.е. клетках, получившихся в результате слияния клеток — продуцентов антител и клеток злокачественной миеломы. Гибридомы клеток мышей легко выращивать, так как они образуют опухоли у лабораторных животных. Моноклональные антитела человека эффективны как терапевтические средства, но методы выращивания гибридом человека в культуре еще не разработаны.

Большие перспективы открывает в медицине использование фермента урокиназы. При участии урокиназы плазминоген превращается в фермент плазмин, который разрушает тромбы. Урокиназу лучше всего выделять из почечных клеток человека, но их трудно выращивать в большом количестве. Свои проблемы есть и у фармакологов, занятых разработкой новых средств, влияющих на развитие сосудов и на рост опухолей. В этих исследованиях нужны так называемые ангиогенные факторы (факторы роста сосудов),

причем в больших количествах. В норме эти вещества действуют как межклеточные регуляторы — они способствуют росту кровеносных сосудов. Специфические опухолевые ангиогенные факторы, которые образуются в опухолевых клетках, вызывают васку-ляризацию и рост опухолей. Сейчас изучают возможность массированного применения препаратов, содержащих ангиогенные факторы; предполагается, что таким путем можно индуцировать новообразование сосудов.

Интересны также поверхностные антигены клеток человека. С их помощью клетки узнают друг друга — отличают «своих» от «чужих», они различны в опухолевых и в нормальных клетках. Поверхностные антигены

—        предмет активных исследований. Потребность в них велика, и удовлетворить ее можно одним путем — массовым культивированием клеток.

Большая практическая ценность этих и ряда других соединений побудила исследователей заняться поиском методов массового культивирования клеток млекопитающих. Ученых, работающих в этой области, не останавливают даже очевидные успехи генной инженерии. Мы знаем, что теперь есть методы, при помощи которых в бактерию можно ввести ген, ответственный за синтез нужного белка, и заставить бактериальную клетку его синтезировать. Но далеко не все биологически важные соединения можно получить методами генной инженерии. Когда мы имеем дело с мало изученными веществами, такими, как ангиогенные факторы, остается одно — выращивать клетки, которые их синтезируют, и выделять из них интересующие нас соединения.

Культивирование клеток млекопитающих начинается с того, что какую-то ткань животного тщательно измельчают механически или при помощи ферментов (иногда эти два способа сочетают). В результате получают смесь из отдельных клеток и их агломератов. Эту смесь переносят в соответствующую питательную среду, в состав которой обычно входят соли, глюкоза, некоторые аминокислоты и сыворотка крови (на долю сыворотки обычно приходится от 5 до 20% объема всей жидкости). Сыворотка в такой искусственной среде служит источником веществ, которые не идентифицированы, но, как показал опыт, совершенно необходимы для жизнедеятельности клеток и их роста в культуре. Сыворотка — дорогой препарат, и именно это обстоятельство, как правило, определяет экономическую целесообразность культивирования клеток. Так как в культуре клетки не находятся под защитой иммунной системы организма, во избежание инфекции обычно приходится добавлять в среду антибиотики. Необходимо также внимательно следить за pH среды, температурой, содержанием кислорода и углекислого газа. Приходится также контролировать содержание солей, поскольку, чтобы обеспечить целостность легко повреждаемых клеточных мембран, необходимо поддерживать определенное осмотическое давление.

Большинству клеток млекопитающих надо прикрепляться к какой-то поверхности, но клетки крови и лимфы, клетки опухолей и некоторые другие трансформированные клетки растут и в суспензионных культурах. Суспензию клеток можно держать просто в колбе, перемешивая среду магнитной мешалкой — она вращается внутри сосуда благодаря магнитному приводу под дном колбы. Такие колбы емкостью от 25 мл до 15 л и применяют в лабораториях. Для культивирования клеток, растущих только в прикрепленном состоянии (к ним относится большинство нормальных клеток), придумано множество приспособлений: здесь и плоскодонные чашки Петри, и многолунковые пластинки, и разнообразные флаконы. Лучше всего клетки растут во вращающихся бутылях — сосудах цилиндрической формы, лежащих в горизонтальном положении. Клетки прикрепляются к внутренней их поверхности. При медленном вращении сосуда (около одного оборота в минуту) клетки попеременно то погружаются в питательную среду, то оказываются в воздухе. В самых больших бутылях площадь внутренней поверхности, на которой могут расположиться клетки, составляет около 1600 см2.

Для ВЫРАЩИВАНИЯ клеток в суспензионных культурах разработаны реакторы большого объема. За основу взяли ферментеры для одноклеточных микроорганизмов. Однако по ходу дела обнаружились существенные недостатки таких систем. Прежде всего построенные по образцу ферментеров реакторы были сложной конструкции и стоили дорого. Чтобы создать в них асептические условия, приходилось применять для стерилизации сложное оборудование и вводить в среду антибиотики.

Массовое выращивание прикрепляющихся к поверхностям клеток еще труднее. До недавнего времени выход находили простейшим способом: увеличивали число сосудов для культивирования.

Несколько лет назад в нашей лаборатории в научно-исследовательском центре Monsanto Company начали разрабатывать новые системы для массового культивирования клеток. Нам необходимо было устройство, позволяющее получать еженедельно сотни литров суспензионной культуры клеток. Желательно было сделать такую систему, для стерильности которой антибиотики не нужны. Дело в том, что в присутствии антибиотиков иногда бывает трудно заметить медленно развивающееся загрязнение среды микроорганизмами; кроме того, антибиотики могут непредсказуемым образом влиять на обмен веществ культивируемых клеток. Решено было собрать установку из отдельных модулей: большой объем продукции можно было бы получать, просто увеличивая число одновременно действующих отдельных сосудов для культивирования. Нам хотелось также применить некоторые новые приспособления, поскольку крупным, легко повреждаемым клеткам млекопитающих нужно было создать особые условия.

Для этих целей мы разработали недорогой, простой по устройству 100-литровый реактор. Основная его часть — барабан объемом 120 л, он сделан из нержавеющей стали и снабжен съемной головкой, через которую проходят все вводы и выводы системы. Реактор не такой уж большой, так что его можно стерилизовать в автоклаве. В съемной его части есть специальное устройство, позволяющее отбирать пробы из культуры без риска занести при этом инфекцию. Для перемешивания служит вибратор, разработанный в 1965 г. Дж. Муром, сотрудником Института имени Росвела Парка. Этот вибратор представляет собой диск с коническими отверстиями, прикрепленный к вертикальному стержню. Стержень вибрирует с высокой частотой, и жидкость перемешивается — причем главным образом в вертикальном направлении — благодаря колебаниям диска, сквозь отверстия которого она проходит. Движение передается вибратору посредством гибкой диафрагмы в верхней части реактора, так что устройство Мура имеет еще одно преимущество: сохраняется герметичность сосуда. Кислород в среду поступает по шлангам, проходящим через головку реактора; так же удаляется

воздух, насыщенный углекислым газом.

Мы сделали несколько таких 100-литровых реакторов, причем расходы составили всего двадцатую часть от стоимости обычных ферментеров. В реакторах можно с успехом выращивать в суспензионной культуре самые разнообразные клетки; за прошедшие несколько лет мы получили сотни тысяч литров суспензионных культур клеток человека и грызунов. Несмотря на очевидный успех, работая над созданием более крупных реакторов, мы решили не копировать эту конструкцию, просто увеличив ее, а разработать новую систему. Нам хотелось больше приблизить условия в культуре к естественным условиям существования клеток млекопитающих.

В НАШЕЙ системе со 100-литровым реактором клетки растут в меняющихся условиях. Вначале среда богата всеми необходимыми веществами и практически не содержит конечных продуктов метаболизма. Со временем доля полезных веществ в среде уменьшается, а доля отходов соответственно растет, что ограничивает размножение клеток и плотность культуры. Живой организм обеспечивает своим клеткам совсем иные условия — условия гомеостаза. Система кровообращения бесперебойно поставляет клеткам кислород и питательные вещества, она же удаляет углекислый газ и другие отходы жизнедеятельности. Несмотря на то что плотность клеток в живой ткани в 500-1000 раз больше, чем в культуральной жидкости, каждая клетка существует в стабильных условиях. К такому постоянству культуральной среды и надо стремиться. Для этого можно, например, постоянно вводить в культуру свежую питательную среду и удалять отработанную; трудность здесь в том, что среда должна сменяться, а клетки оставаться на месте. В 1969 г. Ф. Хим-мельфарб и Ф. Тейер (Arthur D. Little, Inc.) разработали проточную систему для культивирования клеток млекопитающих в суспензиях. Плотность клеток в среде у них оказалась гораздо выше, чем в обычных суспензионных культурах.

Мы также создали небольшие проточные установки с 4- и 44-литровым реакторами, в которых можно вырастить столько же клеток, сколько и в 100- и 1000-литровом реакторах обычной конструкции. Среда в этих реакторах сменяется при помощи вспомогательного сосуда с цилиндрическим фарфоровым фильтром с порами менее

2          мкм. Фильтр задерживает клетки, часть отфильтрованной среды снова попадает в реактор для повторного использования, а часть идет в отходы. Убыль жидкости восполняется свежей питательной средой. Для того чтобы клетки и их обломки не забивали поры фильтра, его вращают; для той же цели можно использовать механическую мешалку. И в том и в другом случае слои жидкости вблизи поверхности фильтра смещаются, не давая клеткам оседать на фильтре. При помощи специальных датчиков, приспособления для отбора проб, системы питающих и отводящих шлангов в реакторе можно контролировать pH среды и поддерживать оптимальный уровень кислорода, углекислого газа и питательных веществ даже при активном размножении клеток и высокой плотности культуры.

Для культур с большой плотностью необходимы щадящие способы перемешивания. Мы применили следующую конструкцию. Четыре гибкие лопасти.

сплетенные из нейлоновых нитей, медленно (8 — 20 об/мин) вращаются в реакторе. Концы лопастей движутся, как рыбий хвост, и перемешивают жидкость. Так как энергия движения такой мешалки распределяется на всю площадь лопастей, перемешивание полу чается довольно деликатным и клетки не повреждаются.

Чтобы сравнить эффективность проточных и обычных систем, мы выращивали крысиные опухолевые клетки и в тех и в других реакторах. Мы определяли концентрацию глюкозы и молочной кислоты (молочная кислота — основной продукт обмена веществ) в удаляемой из реакторов среде. Скорость роста культуры в реакторах обоих типов была одинаковой, но плотность клеток в проточной системе оказалась гораздо выше — около 25 млн. клеток на 1 мл жидкости против 1 млн. на 1 мл в реакторе обычного типа. При максимальной плотности культуры в проточном реакторе все клетки оставались живыми, а в обычных реакторах 30% погибало. Не следует пренебрегать и экономической стороной дела: выход клеток на 1 л среды был в проточных реакторах в 2,5 раза выше (и это при том, что среду через проточные реакторы прокачивают). Более того, проточный реактор может работать как своего рода хемостат: часть среды с клетками можно отбирать и таким путем поддерживать оптимальную плотность культуры.

Напомним, что большинство клеток млекопитающих может расти, только прикрепившись к поверхности стенок сосуда для культивирования. К сожалению, отношение площади стенок к объему во флаконах и во вращающихся бутылях невелико. Для выращивания клеток в большом количестве это не годится. Было предложено немало хитроумных способов, как увеличить отношение поверхности к объему: клетки выращивали на губчатых полимерах, на тонких трубочках или нитях, стопках тонких пластинок либо крошечных гранулах (микроносителях). Мы попытались приспособить для массового культивирования клеток гранулы-микроносители и нитевидные трубочки.

В наших исследованиях и в работах Р. Кнацека и его сотрудников (Национальный институт рака) выяснилось,

что клетки млекопитающих хорошо растут на трубочках с внешним диаметром от-до мм. Трубочки следует брать пористые, чтобы проходящий через них воздух мог диффундировать к клеткам, которые растут на наружной поверхности трубочек, омываемой питательной средой. Из множества способов расположения носителей мы выбрали «плоскую подушку» : трубочки размещали в реакторе в 3—6 слоев.

Свежая питательная среда поступает в реактор под подушку из трубочек, проходит сквозь нее и затем удаляется из верхней части реактора. Чтобы ток жидкости был равномерным и перпендикулярным плоскости подушки, среду прокачивают через микропористый фильтр. Он представляет собой пластинку из нержавеющей стали с отверстиями диаметром 2 мкм. Другой фильтр с отверстиями диаметром 20 мкм помещают над подушкой, чтобы уменьшить противоток жидкости. Преимущество такой конструкции в том, что расстояние между входом и выходом системы очень небольшое (в отличие, например, от цилиндрического «патрона», в котором жидкость движется параллельно нитям). По этой причине в установке почти нет градиентов концентрации питательных веществ и отходов жизнедеятельности клеток и клетки постоянно омываются практически свежей средой. Концы трубочек соединяют нетоксичным эластичным веществом, а затем, срезав начало и конец пучка трубочек по этому месту, их подсоединяют к системе, обеспечивающей циркуляцию воздуха и углекислого газа.

Мы сделали два реактора-прототипа; в одном площадь подушек из трубочек была 930 см2, а в другом 9300 см2, причем больший из них имел размеры всего 40 см2 х 4,5 см. В течение долгого времени в этих реакторах удавалось поддерживать культуры с высокой плотностью клеток. В малом реакторе мы выращивали культуру легочных клеток человека. Плотность культуры достигла 1 млн. клеток на 1 см2 поверхности трубочек, что в 10 раз больше, чем при культивировании во вращающихся цилиндрических бутылях. В этих установках особенно удачно решена задача смены среды: скорость ее протекания можно отрегулировать таким образом, чтобы содержание питательных веществ и отходов при размножении клеток не менялось. Обычно для этого следят за содержанием молочной кислоты на выходе реактора — по нему судят о количестве клеток, выросших на трубочках, и в зависимости от их массы устанавливают необходимую скорость поступления свежей питательной среды.

В таком реакторе вырастает не просто много клеток. В нем, по сути дела, образуется искусственная ткань. Миллиарды клеток сплошным слоем покрывают трубочки и растут даже внутри них. В наших опытах огромные колонии клеток жили в благоприятных условиях очень долго — от 21 до 59 дней. Все это время клетки непрерывно синтезировали нужные нам вещества

—        урокиназу и ангиогенный фактор, которые мы выделяли из среды, прошедшей через реактор. Если культура

не загрязняется микроорганизмами, то такая система может работать долго. Когда рост культуры закончится, дорогую сывороточную среду для культивирования можно заменить на более дешевую — с небольшой долей сыворотки или совсем без нее. Клетки при этом чувствуют себя прекрасно и продолжают продуцировать биологически активные вещества.

Культивирование клеток на микроносителях впервые осуществил в 1967 г. А. Ван-Везель в Национальном институте здравоохранения Голландии. С тех пор появилось множество вариантов этого метода для промышленных целей небольших масштабов. Гранулы микроносителя делают из природного полимера глюкозы — декстрана — или какого-либо синтетического полимера; размер их — от 50 мкм до нескольких сотен микрометров в диаметре. Микроносители суспендируют в культуральной среде, затем добавляют клетки, которые прикрепляются к поверхности гранул и начинают размножаться. Система с микроносителями хороша тем, что, хотя клетки растут на поверхности гранул, мы, по сути дела, имеем суспензионную культуру, поскольку сами гранулы взвешены в жидкости. Это позволяет применять установки, предназначенные для суспензий клеток.

Впрочем, выращивание клеток на микроносителях в реакторах для суспензионных культур не очень рационально. Приходится контролировать не только состав среды, но и распределение в системе микроносителей. При энергичном перемешивании гранулы часто сталкиваются, клетки на них повреждаются. С одной стороны, гранулы нужно хорошо суспендировать, а с другой — нельзя допускать массовой гибели клеток. Пришлось разработать особые, щадящие способы перемешивания. Чтобы выращивать клетки в большом количестве, нужна соответственно большая площадь поверхности, значит, необходима высокая плотность гранул в среде. Но чем она выше, тем чаше гранулы сталкиваются. В случае микроносителей отношение поверхности к объему среды велико, что благоприятно для клеток, и они бурно размножаются, но соответственно быстро истощается среда, в ней накапливаются токсичные продукты обмена веществ. Выросшую культуру далеко не просто перенести в реактор большего объема: для этого надо снять клетки с гранул и суспендировать их в свежей среде с новыми гранулами. При работе с обычными реакторами для суспензионных культур отделить клетки от гранул без больших потерь не удается.

Мы приспособили для микроносителей проточный реактор и добились заметного увеличения плотности клеток в культуре.

Мешалка с гибкими лопастями достаточно деликатно и в то же время эффективно перемешивала суспензию гранул; при небольшой скорости вращения (8 — 20 об/мин) можно было создать высокую концентрацию гранул

—        до 12 г/л, а клетки при этом не повреждались. Конструкцию нашего проточного реактора для этих опытов пришлось несколько изменить. Между основным сосудом и сосудом с фильтром мы поместили ловушку гранул. Среда прокачивается к фильтру, и по пути гранулы, покрытые клетками, попадают в ловушку-отстойник, где и собираются на дне. В ловушке гранулы не перемешиваются, они начинают слипаться и образуют густой осадок, который постепенно перетекает в основстихи из клеток, на них нарастают еще клетки, так что общее число клеток иногда вчетверо больше, чем может поместиться на поверхности гранул. Агрегация клеток и гранул неожиданно решила проблему переноса культуры в реактор большего объема. Оказалось, что в комочках клетки слабее связаны с гранулами, видимо, потому, что сильны межклеточные взаимодействия. Если откачать из реактора культуру и обработать ее ферментом трипсином, клетки легко отделяются от гранул без всяких повреждений.

Проточный реактор с микроносителями оказался очень удачным для массового культивирования клеток, которым необходимо прикрепляться к поверхности. Давно известно, что гранулы обеспечивают культуре большую поверхность для роста. Теперь мы научились снимать урожай со всего этого поля, и даже многократный урожай, если использовать эффект образования мостиков между клетками. Весь секрет в том, что в проточном реакторе клеткам создаются оптимальные условия для роста и размножения даже при высокой плотности культуры, а она здесь в 5—10 раз больше, чем в обычных реакторах.

Соединение двух приемов — выращивание культур с высокой плотностью клеток и перенос их в реактор большего объема — дало поразительные результаты. Так, в одном из опытов мы вырастили в маленьком (4-литровом) проточном реакторе 40 млрд. фибробластов человека. Чтобы получить такое количество клеток во вращающихся бутылях, нужно 1300 сосудов. Фибробласты отделили от гранул микроносителей и перенесли в 44-литровый реактор, добавив 400 г новых гранул (общая площадь их поверхности 188 м2). Второй цикл культивирования дал 340 млрд. клеток. Чтобы получить такой урожай, нужно было бы взять 11 000 вращающихся бутылей. Полученные таким методом фибробласты дали нам не только интерферон, но и урокиназу, и ангиогенный фактор. Наилучший показатель экономичности проточной системы на микроносителях — число выращенных клеток в расчете на литр израсходованной культуральной среды, оно приблизительно в 4 раза больше, чем для вращающихся бутылей.

Такие высокопроизводительные и экономичные системы для массового выращивания разнообразных клеток млекопитающих без антибиотиков найдут самое широкое применение как в научных исследованиях, так и в промышленности. Эффективная новая технология позволит не только глубже изучить биологические процессы, но и получать вещества, которые так нужны в медицине.