Одна из самых неприятных задач биологов-выяснить, как белки, молекулы, несущие основную тяжесть работы клетки, выполняют свою работу. Каждый белок имеет множество бугорков, складок и трещин на своей поверхности, которые диктуют, что он может делать. Ученые могут довольно легко визуализировать эти особенности на отдельных белках. Но белки не действуют в одиночку, и ученым также необходимо знать форму и состав—структуру, как они это называют,—комплексов, которые белки образуют при совместной работе.

Обладая точной информацией о структуре белковых комплексов, ученые имеют больше шансов разработать эффективные препараты для блокирования или повышения активности комплексов для терапевтического применения. Они также могут лучше предвидеть, как мутация может нарушить комплекс и привести к болезни.

Но определение структуры белковых комплексов - дело кропотливое. Каждый комплекс индивидуален,нет единого способа определить его структуру, и мало средств для ускорения процесса. Самое главное, что методы, дающие наиболее точную структурную информацию, предполагают выведение комплексов из их естественного контекста-клетки. В результате ученые, изучающие структуру, сталкиваются с мучительным сомнением: действительно ли она отражает то, как комплекс выглядит и работает, когда он все еще находится в клетке?

В конечном счете, белки происходят из генов, и поскольку с генами оказалось легче работать, чем с белками, некоторые ученые ищут гены и быстро растущий арсенал генетических инструментов, чтобы облегчить определение белковых структур.

Теперь группа ученых из Института Гладстона и Калифорнийского университета в Сан-Франциско (UCSF) продемонстрировала, что крупномасштабный и систематический генетический подход действительно может дать надежную и подробную информацию о структуре белковых комплексов. Их результаты опубликованы в журнале Science.

"Наша методика позволяет нам собирать большие объемы структурных данных из живых клеток, отражающих, как белки работают в их нормальной среде, а не в искусственных лабораторных условиях", - говорит Неван Кроган, доктор философии, который руководил исследованием и является старшим исследователем в Гладстоне, а также профессором клеточной и молекулярной фармакологии и директором Института количественных биологических наук (QBI) в UCSF. "Раньше это было невозможно в таких масштабах, и это должно значительно ускорить процесс определения структуры белковых комплексов, в том числе тех, которые трудно решить традиционными методами."

Этот подход основан на технологии, которую Кроган впервые назвал генетическим отображением взаимодействия. Он просматривает тысячи комбинаций мутаций генов в живых клетках и за относительно короткое время может выявить гены, белковые продукты которых работают в общих клеточных процессах. Кроган и его команда увеличили разрешающую способность этих экранов и успешно смоделировали два белковых комплекса в дрожжевых клетках и один в бактериальных клетках.

Кроган рассматривает этот прогресс не как замену другим способам определения структуры белков, а как важнейшее дополнение, часть стратегии под названием "интегративное моделирование", впервые предложенной Андреем Сали, профессором UCSF и соавтором этого проекта.

"Объединение генетических данных с наших экранов с другой структурной информацией повысило точность наших моделей", - говорит Кроган. "Наше исследование подчеркивает силу интегративного моделирования и ценность объединения нескольких наборов данных, собранных совершенно разными способами."

От дрожжей до человеческих клеток и болезней

Белки - это цепочки строительных блоков, называемых аминокислотами. Расшифровка структуры белкового комплекса состоит главным образом в выяснении того, какие участки аминокислот оказываются близко друг к другу, когда комплекс собирается. В большинстве случаев это достигается с помощью биохимии.

Вместо этого Кроган и его команда полагались на генетику и изучали, как аминокислоты комплекса ведут себя на их крупномасштабных экранах. Идея состоит в том, что если две аминокислоты находятся близко друг к другу—скажем, в пределах одной и той же шишки или щели на поверхности комплекса,—они, вероятно, выполняют аналогичные функции для комплекса. Поэтому на генетическом экране две аминокислоты должны взаимодействовать с одними и теми же генами. Но белковые комплексы действительно сложны, с различными областями, потенциально влияющими друг на друга или выполняющими сходные функции.

"Таким образом, если две аминокислоты в комплексе взаимодействуют с одним и тем же геном, они могут быть или не быть близки друг к другу",-говорит Ханнес Браберг, доктор философии, соавтор исследования и ученый из QBI, организованного исследовательского подразделения при школе фармации UCSF. "Но если они взаимодействуют с теми же 50 генами из 1000 возможных, то вероятность того, что они действительно близки друг к другу в комплексе, намного выше."

Ученые решили исследовать, можно ли использовать эти рассуждения для определения структуры белковых комплексов в их родной среде—живых, растущих клетках.

Они начали с двух белков, называемых Гистоном Н3 и Гистоном Н4, которые образуют хорошо изученный белковый комплекс. Они провели свой скрининг в дрожжевых клетках и использовали полученную информацию для моделирования структуры комплекса гистонов H3-H4.

"Полученная нами структура соответствовала существующим данным о белковом комплексе", - говорит Браберг. "И эффективность нашего метода сравнима с широко используемым биохимическим подходом, что примечательно, учитывая, что данные генетического взаимодействия основаны исключительно на наблюдении за тем, как хорошо растут клетки!"

Успех их подхода не ограничивался комплексом Н3-Н4, поскольку исследователи получили аналогичные результаты с двумя другими белковыми комплексами, одним в дрожжах и одним в бактериальных клетках. Это служит хорошим предзнаменованием для широкого применения подхода ко многим другим комплексам, особенно комплексам, которые не поддаются легко традиционным методам, потому что, например, они встроены в другие клеточные компоненты или слишком велики или слишком короткоживущи.

"Недавние достижения в редактировании генома CRISPR-Cas9 также должны позволить нам расширить наш подход к человеческим клеткам", - говорит Кроган. "Эта возможность открывает захватывающие перспективы для изучения заболеваний, вызванных мутациями генов или патогенами."

Объединив CRISPR с экранами генетического взаимодействия, Кроган и его команда смогут точно описать влияние мутаций болезни на структуру белковых комплексов и выявить изменения, имеющие отношение к болезни. Его команда недавно использовала генетические экраны взаимодействия для изучения интерфейса между вирусами и человеческими клетками. Основываясь на этой работе, они теперь могут вводить специфические мутации в геном патогена и использовать генетические профили взаимодействия белков человека-хозяина, чтобы понять последствия инфекции в живых клетках.

"Этот проект, использующий генетические экраны взаимодействия для информирования о структурном понимании белковых комплексов, начался 15 лет назад", - говорит Кроган. "Мы продолжали совершенствовать этот подход и наращивать его мощь на протяжении многих лет, и очень приятно видеть беспрецедентную разрешающую способность, с которой он теперь может информировать нас о биологических явлениях, происходящих внутри живых клеток."

ИСТОЧНИК