Лечение изнурительных генетических заболеваний - одна из важнейших задач современной медицины. В течение последнего десятилетия развитие технологий CRISPR и достижения в области генетических исследований принесли новую надежду пациентам и их семьям, хотя безопасность этих новых методов по-прежнему вызывает серьезную озабоченность.

Опубликованная 1 июля в журнале Science Advances команда биологов из Калифорнийского университета в Сан-Диего, в которую входят постдокторант Ситара Рой, специалист Аннабель Гишар и профессор Итан Бир, описывает новый, более безопасный подход, который может исправить генетические дефекты в будущем. Их стратегия, в которой используется естественный механизм восстановления ДНК, обеспечивает основу для новых стратегий генной терапии с потенциалом для лечения широкого спектра генетических заболеваний.

Во многих случаях люди, страдающие генетическими нарушениями, несут различные мутации в двух копиях генов, унаследованных от их родителей. Это означает, что часто мутация на одной хромосоме будет иметь функциональный аналог последовательности на другой хромосоме. Исследователи использовали инструменты генетического редактирования CRISPR, чтобы использовать этот факт.

"Здоровый вариант может быть использован репаративным механизмом клетки для исправления дефектной мутации после вырезания мутантной ДНК", - сказал Гишар, старший автор исследования. "Примечательно, что это может быть достигнуто еще более эффективно простым безвредным надрезом".

Работая с плодовыми мухами, исследователи создали мутантов, позволяющих визуализировать такую "гомологичную хромосомно-шаблонную репарацию", или HTR, путем выработки пигментов в их глазах. У таких мутантов изначально были полностью белые глаза. Но когда те же самые мухи экспрессировали компоненты CRISPR (направляющую РНК плюс Cas9), у них появлялись большие красные пятна на глазах, признак того, что механизм репарации ДНК клетки успешно обратил мутацию вспять, используя функциональную ДНК из другой хромосомы.

Затем они протестировали свою новую систему с вариантами Cas9, известными как "никазы", которые нацеливались только на одну нить ДНК вместо обеих. Удивительно, но авторы обнаружили, что такие порезы также приводили к восстановлению красного цвета глаз на высоком уровне, почти наравне с нормальными (не мутировавшими) здоровыми мухами. Они обнаружили 50-70% успеха репарации с помощью nickase по сравнению всего с 20-30% при двухцепочечной резке Cas9, которая также генерирует частые мутации и нацелена на другие участки по всему геному (так называемые нецелевые мутации). "Я не мог поверить, насколько хорошо сработал nickase — это было совершенно неожиданно", - сказал Рой, ведущий автор исследования. Исследователи отметили, что универсальность новой системы может послужить моделью для фиксации генетических мутаций у млекопитающих.

"Мы пока не знаем, как этот процесс отразится на клетках человека и сможем ли мы применить его к какому-либо гену", - сказал Гишар. "Возможно, потребуется некоторая корректировка для получения эффективного HTR для вызывающих заболевание мутаций, переносимых человеческими хромосомами".

Новое исследование расширяет предыдущие достижения группы в области точного редактирования с помощью "аллельных приводов", которые расширяют принципы генных приводов с направляющей РНК, которая направляет систему CRISPR на удаление нежелательных вариантов гена и замену их предпочтительной версией гена.

Ключевой особенностью исследования команды является то, что их система, основанная на nickase, вызывает гораздо меньше мутаций, связанных и не связанных с целью, как это, как известно, происходит с более традиционными изменениями CRISPR на основе Cas9. Они также говорят, что медленная непрерывная доставка компонентов nickase в течение нескольких дней может оказаться более выгодной, чем разовые поставки.

"Еще одним заметным преимуществом этого подхода является его простота", - сказал Бир. "Он основан на очень небольшом количестве компонентов, а зазубрины ДНК "мягкие", в отличие от Cas9, который вызывает полные разрывы ДНК, часто сопровождающиеся мутациями".

"Если бы частоту таких событий можно было увеличить либо путем поощрения межмолекулярного спаривания, либо путем оптимизации процессов репарации, специфичных для nick, такие стратегии можно было бы использовать для коррекции многочисленных доминантных или трансгетерозиготных мутаций, вызывающих заболевание", - сказал Рой.

ИСТОЧНИК