Технология редактирования генов CRISPR, получившая Нобелевскую премию, готова вновь оказать глубокое влияние на области микробиологии и медицины.

Команда, возглавляемая пионером CRISPR Дженнифер Дудной и ее давней сотрудницей Джилл Банфилд, разработала умный инструмент для редактирования геномов заражающих бактерии вирусов, называемых бактериофагами, с использованием редкой формы CRISPR. Способность легко создавать специально разработанные фаги, которая долгое время ускользала от научного сообщества, может помочь исследователям контролировать микробиомы без антибиотиков или агрессивных химикатов и лечить опасные лекарственно—устойчивые инфекции. Статья, описывающая эту работу, была недавно опубликована в журнале Nature Microbiology.

"Бактериофаги - одни из самых распространенных и разнообразных биологических организмов на Земле. В отличие от предыдущих подходов, эта стратегия редактирования работает против огромного генетического разнообразия бактериофагов", - сказал первый автор Бенджамин Адлер, аспирант лаборатории Дудны. "Здесь так много интересных направлений — открытия буквально у нас под рукой".

Бактериофаги, также называемые просто фагами, вводят свой генетический материал в бактериальные клетки с помощью устройства, похожего на шприц, затем захватывают белковый механизм своих хозяев, чтобы размножаться, обычно убивая бактерии в процессе. (Они безвредны для других организмов, включая нас, людей, хотя изображения с помощью электронной микроскопии показали, что они похожи на зловещие космические корабли пришельцев.)

CRISPR-Cas - это тип механизма иммунной защиты, который многие бактерии и археи используют против фагов. Система CRISPR-Cas состоит из коротких фрагментов РНК, которые комплементарны последовательностям в генах фагов, позволяя микробу распознавать, когда был введен инвазивный генетический материал, и ножницеобразных ферментов, которые нейтрализуют гены фага, разрезая их на безвредные кусочки, после того, как РНК направит их на место.

На протяжении тысячелетий непрекращающаяся эволюционная битва между нападением фагов и защитой бактерий вынудила фагов специализироваться. Существует множество микробов, поэтому существует также множество фагов, каждый из которых обладает уникальными приспособлениями. Это поразительное разнообразие затруднило редактирование фагов, в том числе сделало их устойчивыми ко многим формам CRISPR, поэтому наиболее часто используемая система — CRISPR-Cas9 — не подходит для этого приложения.

"У фагов есть много способов обойти защитные механизмы, начиная от анти-CRISPR и заканчивая просто хорошим восстановлением собственной ДНК", - сказал Адлер. "Таким образом, в некотором смысле, адаптации, закодированные в геномах фагов, которые делают их такими хорошими в манипулировании микробами, являются той же самой причиной, по которой было так трудно разработать универсальный инструмент для редактирования их геномов".

Руководители проекта Дудна и Банфилд совместно разработали множество инструментов на основе CRISPR с тех пор, как они впервые сотрудничали в раннем исследовании CRISPR в 2008 году. Эта работа, выполненная в Национальной лаборатории Лоуренса Беркли (Berkeley Lab), была отмечена Нобелевским комитетом, когда Дудна и другая ее сотрудница, Эммануэль Шарпантье, получили премию в 2020 году.

Команда Дудны и Банфилда из Лаборатории Беркли и Калифорнийского университета в Беркли изучала свойства редкой формы CRISPR под названием CRISPR-Cas13 (полученной из бактерии, обычно встречающейся во рту человека), когда они обнаружили, что эта версия защитной системы работает против огромного спектра фагов.

Способность CRISPR-Cas13 бороться с фагами была неожиданной, учитывая, как мало микробов его используют, объяснил Адлер. Ученые были вдвойне удивлены, потому что фаги, которых он победил в тестировании, все заражают с помощью двухцепочечной ДНК, но система CRISPR-Cas13 нацелена только на одноцепочечную вирусную РНК и расщепляет ее.

Как и другие типы вирусов, некоторые фаги имеют геномы на основе ДНК, а некоторые - на основе РНК. Однако все известные вирусы используют РНК для экспрессии своих генов. Система CRISPR-Cas13 эффективно нейтрализовала девять различных ДНК-фагов, которые все заражают штаммы E. coli, но почти не имеют сходства в их геномах.

По словам соавтора и эксперта по фагам Вивека Муталика, штатного ученого в области биологических наук Лаборатории Беркли, эти результаты указывают на то, что система CRISPR может защищать от различных фагов на основе ДНК, нацеливаясь на их РНК после того, как она была преобразована из ДНК собственными ферментами бактерий до трансляции белка.

Затем команда продемонстрировала, что систему можно использовать для редактирования геномов фагов, а не просто для защиты.

Сначала они создали сегменты ДНК, состоящие из последовательности фага, которую они хотели создать, в окружении нативных последовательностей фага, и поместили их в бактерии-мишени фага. Когда фаги заражали микробы, нагруженные ДНК, небольшой процент фагов, размножающихся внутри микробов, поглощал измененную ДНК и включал ее в свои геномы вместо исходной последовательности.

Этот шаг представляет собой давний метод редактирования ДНК, называемый гомологичной рекомбинацией. Многолетняя проблема в исследованиях фагов заключается в том, что, хотя этот этап, фактическое редактирование генома фага, работает просто отлично, выделение и репликация фагов с отредактированной последовательностью из большего пула нормальных фагов очень сложны.

Вот тут-то и пригодится CRISPR-Cas13. На втором этапе ученые сконструировали другой штамм микроба-хозяина, содержащий систему CRISPR-Cas13, которая распознает и защищает от нормальной последовательности генома фага. Когда фаги, созданные на первом этапе, подвергались воздействию хозяев второго раунда, фаги с исходной последовательностью были побеждены системой защиты CRISPR, но небольшое количество отредактированных фагов смогли избежать этого. Они выжили и воспроизвели сами себя.

Эксперименты с тремя неродственными фагами E. coli показали ошеломляющий процент успеха: более 99% фагов, полученных в ходе двухэтапных процессов, содержали изменения, которые варьировались от огромных удалений нескольких генов вплоть до точной замены одной аминокислоты.

"На мой взгляд, эта работа по фаговой инженерии является одной из главных вех в биологии фагов", - сказал Муталик. "Поскольку фаги влияют на микробную экологию, эволюцию, динамику популяций и вирулентность, бесшовная инженерия бактерий и их фагов имеет глубокие последствия для фундаментальной науки, но также имеет потенциал для реального изменения всех аспектов биоэкономики. В дополнение к здоровью человека, эти возможности фаговой инженерии повлияют на все - от биомедицины и сельского хозяйства до производства продуктов питания".

Воодушевленные своими первоначальными результатами, ученые в настоящее время работают над расширением системы CRISPR, чтобы использовать ее на большем количестве типов фагов, начиная с тех, которые влияют на микробные сообщества почвы. Они также используют его как инструмент для изучения генетических тайн в геномах фагов. Кто знает, какие еще удивительные инструменты и технологии могут быть вдохновлены трофеями микроскопической войны между бактериями и вирусами?