Общепринятый научный метод анализа крошечного количества ДНК в ранних человеческих эмбрионах не может точно отразить редактирование генов, говорится в новом исследовании ученых из Орегонского университета здоровья и науки.

Исследование, опубликованное сегодня в журнале Nature Communications, включало секвенирование геномов ранних человеческих эмбрионов, подвергшихся редактированию генома с помощью инструмента редактирования генов CRISPR. Работа ставит под сомнение точность процедуры считывания ДНК, которая основана на амплификации небольшого количества ДНК для целей генетического тестирования.

Кроме того, исследование показывает, что редактирование генов для исправления вызывающих заболевания мутаций в ранних человеческих эмбрионах также может привести к непреднамеренным и потенциально вредным изменениям в геноме.

В совокупности эти результаты дают новое научное обоснование для осторожности любого ученого, который может быть готов использовать генетически отредактированные эмбрионы для установления беременности. Несмотря на то, что технологии редактирования генов обещают стать перспективными в профилактике и лечении изнурительных наследственных заболеваний, новое исследование показывает ограничения, которые должны быть преодолены, прежде чем редактирование генов для установления беременности можно будет считать безопасным или эффективным.

"Это говорит о том, как мало мы знаем о редактировании генома, и особенно о том, как клетки реагируют на повреждения ДНК, которые вызывает CRISPR", - сказал старший автор Шухрат Миталипов, доктор философии, директор Центра эмбриональных клеток и генной терапии OHSU, профессор акушерства и гинекологии, молекулярных и клеточных бионаук Школы медицины OHSU, Орегонского национального центра исследования приматов OHSU. "Генная репарация имеет большой потенциал, но эти новые результаты показывают, что нам предстоит еще много работы".

Результаты исследования были получены во время Третьего международного саммита по редактированию генома человека в Лондоне. Накануне последнего международного саммита, проходившего в Гонконге в ноябре 2018 года, китайский ученый сообщил о рождении первых в мире младенцев, полученных в результате редактирования генома эмбрионов в ходе эксперимента, который вызвал глобальное осуждение.

Неправильная диагностика эмбрионов

Прежде чем отредактированный эмбрион будет перенесен для установления беременности, важно убедиться, что процедура прошла так, как было задумано.

Поскольку ранние человеческие эмбрионы состоят всего из нескольких клеток, невозможно собрать достаточно генетического материала для их эффективного анализа. Вместо этого ученые интерпретируют данные, полученные из небольшого образца ДНК, взятого из нескольких или даже одной клетки, который затем должен быть размножен в миллионы раз в ходе процесса, известного как амплификация всего генома.

Этот же процесс - известный как преимплантационное генетическое тестирование, или ПГТ - часто используется для проверки человеческих эмбрионов на различные генетические заболевания у пациентов, проходящих процедуру экстракорпорального оплодотворения.

Амплификация целого генома имеет ограничения, которые снижают точность генетического тестирования, говорит старший соавтор Паула Амато, доктор медицинских наук, профессор акушерства и гинекологии в Школе медицины OHSU.

"Беспокойство вызывает то, что мы можем неправильно диагностировать эмбрионы", - сказала Амато.

Амато, который использует экстракорпоральное оплодотворение для лечения пациентов, страдающих бесплодием, а также для предотвращения передачи наследственных заболеваний, говорит, что ПГТ с использованием более современных технологий все еще клинически полезна для выявления хромосомных аномалий и генетических нарушений, вызванных мутацией одного гена, передающейся от родителей к ребенку.

Исследование подчеркивает трудности, связанные с установлением безопасности методов редактирования генов.

"Возможно, мы не сможем достоверно предсказать, что из этого эмбриона получится здоровый ребенок", - сказал Миталипов. "Это серьезная проблема".

Чтобы решить эти проблемы, исследователи OHSU вместе с коллегами из исследовательских институтов Южной Кореи и Китая создали линии эмбриональных стволовых клеток из эмбрионов, подвергшихся генному редактированию. Эмбриональные стволовые клетки растут неограниченно долго и дают достаточно материала ДНК, для анализа которого не требуется амплификация всего генома.

Исследователи говорят, что это открытие подчеркивает подверженный ошибкам характер амплификации всего генома и необходимость проверки редактирования эмбрионов путем создания линий эмбриональных стволовых клеток.

Исследование проверяет процесс восстановления генов

Используя эмбриональные стволовые клетки, новое исследование подтверждает процесс восстановления генов, разработанный в лаборатории Миталипова; результаты исследования были опубликованы в журнале Nature в 2017 году и подтверждены в 2018 году.

В том исследовании ученые вырезали определенную целевую последовательность на мутантном гене, который, как известно, несет донор спермы.

Исследователи обнаружили, что человеческие эмбрионы восстанавливают эти разрывы, используя нормальную копию гена от другого родителя в качестве шаблона. Миталипов и соавторы подтвердили, что этот процесс, известный как преобразование генов, регулярно происходит в ранних человеческих эмбрионах после двухцепочечного разрыва в их ДНК. Такой ремонт, если его использовать для установления беременности путем экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбрионов, теоретически может предотвратить передачу известного семейного заболевания ребенку, а также всем будущим поколениям семьи.

В исследовании, опубликованном в 2017 году, ученые OHSU нацелились на ген, который, как известно, вызывает смертельное заболевание сердца.

В новой публикации исследователи нацелились на другие дискретные мутации, используя донорскую сперму и яйцеклетки, включая одну мутацию, известную как причина гипертрофической кардиомиопатии - состояния, при котором сердечная мышца становится аномально толстой, и другую, связанную с высоким уровнем холестерина. В каждом случае фермент, известный как Cas9, используемый в тандеме с CRISPR, вызывал двунитевой разрыв ДНК в точном месте мутации.

Создание проблем

Помимо воспроизведения и подтверждения механизма восстановления генов, о котором сообщалось в 2017 году, новое исследование изучает, что происходит в геноме за пределами конкретного участка, где происходит восстановление мутантного гена. И именно здесь может возникнуть проблема.

В этой работе мы задали вопрос: "Насколько обширен этот механизм восстановления генных преобразований?"" сказал Амато. "Оказалось, что он может быть очень длинным".

Обширное копирование генома от одного родителя к другому создает сценарий, известный как потеря гетерозиготности.

Каждый человек имеет две версии, или аллели, каждого гена в геноме человека - по одной от каждого родителя. В большинстве случаев эти аллели идентичны, поскольку 99,9% последовательности ДНК любого человека является общей для всего человечества. Однако в некоторых случаях один из родителей несет рецессивную мутацию, вызывающую болезнь, которая обычно нивелируется доминантной здоровой версией того же гена у другого родителя.

Такие полиморфизмы в генетическом коде могут быть критически важными. Например, ген может кодировать белок, который защищает от определенных видов рака.

"Если у вас одна аномальная копия рецессивной мутации, это не представляет никакого риска", - говорит Амато. "Но если у вас потеря гетерозиготности, приводящая к появлению двух мутантных копий одного и того же гена-супрессора опухоли, то риск развития рака значительно возрастает".

Чем больше генетического кода копируется, тем выше риск опасных генетических изменений. В новом исследовании ученые измерили участки преобразования генов, начиная от относительно небольшого сегмента и заканчивая целыми 18 600 парами оснований ДНК.

По сути, исправление одной известной мутации может создать больше проблем, чем решить.

"Если вы делаете разрез в середине хромосомы, то там может быть 2 000 генов", - говорит Миталипов. "Вы исправляете одно крошечное место, но все эти тысячи генов выше и ниже по течению могут быть затронуты".

Результаты исследования свидетельствуют о том, что необходимо провести гораздо больше исследований, чтобы понять механизм работы редактирования генов, прежде чем использовать его в клинических целях для установления беременности.